一、脐血造血干/祖细胞冷藏效果的比较研究（论文文献综述）
吴洁莹,陈劲松,吴韶清,陆琰,汤雪薇,李焱[1]（2021）在《三联袋转移法在脐带血制备中的应用效果》文中提出目的探讨无菌环境下,三联袋转移法在脐带血有核细胞分离制备中的应用效果。方法回顾性分析2019年4月～2020年7月广州脐血库的脐血处理数据,按照分离方法分为传统法组（267份）和转移法组（278份）。比较采用传统二次离心法与将脐血转移至空袋后再进行离心的三联袋转移法在脐带血的制备质量和制备效率的差异,比较脐血冻存体积、红细胞去除率、总有核细胞数量和回收率、CD34阳性细胞数量及祖细胞集落数量等质量指标。结果转移法组的脐血平均冻存体积低于传统法组,祖细胞集落数量高于传统法组,差异有统计学意义（P<0.05）。两组的总有核细胞数、有核细胞回收率、红细胞去除率及CD34阳性细胞数量的比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论转移法步骤简便可行,无须增加成本,促进脐血制备质量的提高,具有实际应用价值。
刘青武[2]（2021）在《回阳生肌汤和鸡血藤对慢性皮肤溃疡愈合过程中MSCs趋化和迁移功能的调节作用研究》文中认为背景:慢性皮肤溃疡是糖尿病、放化疗、周围血管病等常见的并发症,是外科常见病及多发病,迁延难愈,愈后常复发。尤其是长期不愈合,呈现疮面清冷,脓液稀薄,疮周紫黯不温的症状,在中医属于阴证疮疡的疮面,治疗难度最大。近年来,以间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）为主的细胞治疗在慢性创面修复中取得较大进展,但植入MSCs修复溃疡的治疗方法,存在细胞来源不稳定、操作复杂、不良反应及费用昂贵等不足,临床使用和推广困难。慢性皮肤溃疡属于中医“疮疡”的范畴,其中慢性皮肤溃疡阴证具有“肾精虚衰”的特点。北京中医医院皮外科奠基人赵炳南教授及其传人王玉章、吕培文教授以益肾填精、活血通络的回阳生肌汤治疗慢性皮肤溃疡阴证安全有效。鸡血藤作为回阳生肌汤活血通络的主要成分,其促进骨髓造血功能的作用受到广泛报道,但鸡血藤用于创面修复的研究较少。干细胞具有中医“肾精”的属性,因此提出回阳生肌汤通过益肾填精、活血通络促进内源性骨髓MSCs的增殖,提升其趋化和迁移能力,达到化生气血、生肌长肉,而促进慢性皮肤溃疡创面愈合的假说。研究将通过体内和体外实验加以验证,探索回阳生肌汤及其主要成分鸡血藤治疗慢性皮肤溃疡阴证的作用和靶点。目的:研究回阳生肌汤及其主要成分鸡血藤促进慢性皮肤溃疡愈合过程中,对MSCs增殖、趋化和迁移功能的调节作用及其机制,为临床中医血管外科防治慢性皮肤溃疡阴证提供实验基础和理论依据。方法:1.回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析:BALB/C小鼠灌胃给药,制备含药血清,采用高效液相色谱串联质谱技术（Ultra-performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）对回阳生肌汤和鸡血藤水提物的入血成分进行分析;2.体内实验:（1）db/db糖尿病小鼠伤口模型:采用db/db糖尿病小鼠背部正中部位全厚层皮肤打孔的方法制备糖尿病伤口模型,并使用回阳生肌汤干预;采用数码相机拍照记录创面大小,分析创面愈合率;采用苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）染色观察创面组织学形态;提取小鼠全骨髓细胞,采用显微镜下计数方法观察骨髓细胞数量;流式细胞术检测骨髓中干细胞标志物CD29、CD44、干细胞表面抗原（Stem cell antigen 1,Sca-1）、CD117阳性细胞比例;免疫荧光染色检测创面中MSCs标志物CD29、CD271阳性细胞数量;炎症因子芯片检测创面中白介素3（Interleukin 3,IL-3）、IL-6、IL-13等炎症因子表达;（2）骨髓抑制大鼠伤口模型:采用尾静脉注射（8mg/kg）的多柔比星联合背部正中部位全厚层皮肤打孔的方法,制备骨髓抑制大鼠伤口模型,并使用回阳生肌汤和鸡血藤水提物进行干预;采用数码相机拍照记录创面大小,分析创面愈合率;称量胸腺及脾脏重量,计算胸腺指数和脾指数;采用血常规检测观察外周血白细胞数量;酶联免疫吸附法（ELISA）检测了大鼠血清中基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1,SDF-1）和粒细胞集落刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor,G-CSF）的浓度;HE及Masson染色并观察创面组织学形态和胶原含量;免疫荧光染色检测创面中CD34、CD133阳性细胞数量;流式细胞术检测骨髓及外周血中CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例;采用骨髓细胞贴壁培养法提取和纯化各组药物干预后大鼠的BMSCs;EdU染色检测BMSCs的增殖能力;划痕和Transwell试验检测BMSCs的迁移和趋化能力;Western Blot法检测SDF-1和趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4,CXCR4）蛋白的相对表达量。3.体外实验:采用全骨髓细胞贴壁培养法纯化大鼠BMSCs;流式细胞术、成脂和成骨分化鉴定BMSCs;使用H2O2刺激BMSCs制作氧化应激BMSCs模型,并使用回阳生肌汤提取物和鸡血藤水提物干预;采用细胞增殖毒性检测试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测BMSCs的增殖活力;划痕试验检测BMSCs的迁移能力;Transwell趋化试验检测BMSCs的趋化能力;Western Blot法检测BMSCs中SDF-1和CXCR4蛋白表达水平。结果:1.回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析:（1）对回阳生肌汤的入血成分进行分析,共得到19个化合物,包括黄酮类,萜类,皂苷类及糖类,含量较高者分别为刺芒柄花苷、汉黄芩素、马钱素、（6αR,11αR）-10-羟基-3,9-二甲氧基紫檀烷、16-氧乙酰茯苓酸甲酯、莫诺苷、核黄素、β-谷甾醇、奥刀拉亭-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷,主要来自鸡血藤、牛膝、苍术、山茱萸、黄芪、茯苓;（2）对鸡血藤水提物的入血成分分析,共得到8个化合物,均为黄酮类化合物,含量由高到低分别为芒柄花黄素、阿夫罗摩辛、异甘草素、大豆素、3,7-二羟基-6-甲氧基二氢黄酮醇、密花豆素、樱黄素、卡亚宁。2.体内实验（1）db/db糖尿病小鼠伤口模型:整体药效观察显示,与模型组比较,回阳生肌汤组小鼠创面愈合率升高;在创面中,与模型组相比,创面肉芽组织新生增多,MSCs 标志物 CD29、CD271 阳性细胞数量增多,IL-3、IL-6、IL-15、Fas 配体（Fas ligand,Fas L）表达升高,IL-13、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、细胞间黏附分子-1（Intercellular Cell Adhesion Molecule-1,ICAM-1）、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、趋化因子LIX/CXCL5表达降低;在骨髓中,与模型组比较,回阳生肌汤组小鼠骨髓细胞数量增加,骨髓中MSCs标志物CD29、CD44、Sca-1阳性细胞比例升高。（2）骨髓抑制大鼠伤口模型:整体药效观察显示,与模型组比较,回阳生肌汤组和鸡血藤水提物可提高模型大鼠的创面愈合率,升高胸腺指数和脾指数;在创面中,与模型组比较,可见回阳生肌汤组和鸡血藤水提物组大鼠中创面炎性细胞数量减少,胶原合成增加,干细胞标志物CD34、CD133阳性细胞数量增多;在骨髓中,CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例增加;在外周血中,与模型组比较,回阳生肌汤和鸡血藤水提物组血清中SDF-1和G-CSF的浓度升高,白细胞数量增加,CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例增多;分离提取药物干预后的原代大鼠BMSCs,与模型组比较,可见回阳生肌汤和鸡血藤水提物组BMSCs增殖细胞数量增加,迁移能力和趋化能力增强,SDF-1和CXCR4蛋白表达增多。3.体外实验:大鼠BMSCs细胞呈梭形,呈旋涡状、席纹状排列,折光性良好;第三代细胞MSCs标志物CD29、CD44阳性细胞比例分别99.9%和97.8%,造血干细胞表面标志物CD45表达率为0.47%。氧化应激状态下的原代大鼠BMSCs的增殖活力降低,趋化和迁移能力下降;与模型组比较,回阳生肌汤和鸡血藤水提物组BMSCs增殖活力升高,迁移和趋化能力增强,SDF-1和CXCR4蛋白表达升高。结论:1.回阳生肌汤和鸡血藤入血成分主要为黄酮类化合物,提示黄酮类化合物在回阳生肌汤和鸡血藤的药效中发挥了重要作用;2.回阳生肌汤干预db/db糖尿病小鼠伤口模型,能够加速创面愈合,并促进小鼠骨髓BMSCs的增殖,增加创面干细胞的数量,调控创面的炎症反应,促进肉芽组织新生;3.回阳生肌汤和鸡血藤水提物干预骨髓抑制大鼠伤口模型,能够促进大鼠血清SDF-1和G-CSF的分泌,且激活模型大鼠BMSCs SDF-1/CXCR4信号轴,促进骨髓干细胞的增殖、迁移和趋化能力,并动员干细胞进入外周血中,增加创面干细胞的数量,促进胶原合成,加速创面的修复;4.回阳生肌汤和鸡血藤水提物在体外作用于大鼠BMSCs,能够激活SDF-1/CXCR4信号轴,保护氧化损伤的BMSCs的活性,提升氧化损伤状态下BMSCs的迁移和趋化能力。
杨最[3]（2020）在《地中海贫血症红细胞谱系发育分化基因筛查及机制研究》文中认为地中海贫血症是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传病。目前临床上地中海贫血症没有可以普遍推广的根治方法。产前诊断在地中海贫血症的预防上有重要贡献。由于产前诊断技术的局限,导致地中海贫血症稀有突变类型不能被检测,不能完全避免地中海贫血症患儿出生。而外显子测序技术有可能弥补这一缺点,因此我们运用外显子测序技术对地中海贫血症基因携带者羊水样本进行检测,既能验证临床产前诊断结果,同时也是为了发现新的变异位点。我们通过外显子测序筛选出1344个共有变异位点。通过对这些共有变异位点进行GO富集分析筛选了26个term,涵盖膜的整体成分、跨膜信号受体活性、细胞外基质结构成分、钙离子结合等;通过KEGG富集分析筛选了13条信号通路,包括糖酵解/糖异生、ECM受体相互作用、补体与凝血级联反应等。这些基因和信号通路可能与地中海贫血症的发病机制密切相关,其结果需要进一步验证。另一方面,珠蛋白基因缺陷影响红细胞发育过程。红细胞的发育起源于造血干细胞,对造血干细胞的机理研究是根治地中海贫血症等一系列血液疾病的潜在突破口。我们利用磁珠分选和流式分选的方法从脐带血样本分离纯化CD34阳性细胞,在体外运用多种细胞因子成功对造血干细胞进行诱导分化,为体外培养造血干细胞模拟体内的造血过程奠定基础。
唐琳[4]（2020）在《人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究》文中认为目的建立小鼠骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）系作为细胞模型,采用RNA-seq技术结合生物信息学手段,分析人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）对小鼠骨髓EPCs增殖影响的差异表达基因及其主要意义,探讨人参皂苷Rg1对小鼠骨髓EPCs促增殖作用的分子机制,为利用人参皂苷Rg1治疗内皮损伤性疾病提供分子生物学水平依据,同时寻找促进EPCs体外生长的关键靶点,为培养数量充足、富有活力的EPCs提供新思路。方法1.采用全骨髓差速贴壁培养法与二次酶消化法相结合,分离和纯化小鼠骨髓EPCs。通过形态学观察、细胞表面抗原表达率检测,进行所获EPCs的细胞鉴定。2.在EPCs的传代培养过程中,选择增殖能力强的细胞,通过有限稀释培养获得单克隆细胞系,并进行传代培养扩增。通过形态学观察、生长特性观察、细胞表面抗原检测、核型分析、体外成血管实验,进行所建细胞系MBMME2的鉴定。3.取小鼠骨髓EPCs的传代细胞和细胞系MBMME2细胞,每种细胞分为7个组,即4个人参皂苷Rg1处理组（终浓度分别为5、10、15、20μmol/L）,空白对照组、溶剂对照组（1.25‰乙醇）和阳性对照组（10-8μmol/L雌激素）,培养96 h,用MTT法检测细胞增殖水平。取小鼠骨髓EPCs传代细胞,按上述分为7个组,培养3周,观察集落形成能力。以上每种细胞分为10μmol/L人参皂苷Rg1组和溶剂对照组,培养96 h,用流式细胞术进行细胞周期分析。4.将MBMME2细胞分为4个组,即3组人参皂苷Rg1处理组（终浓度分别为5、10、20μmol/L）和溶剂对照组,培养96 h,收集总RNA样本,构建cDNA文库、HiSeq测序,建立转录组数据库。经差异表达分析,筛选出差异表达基因（DEGs）,并以DEGs为对象进行基因功能注释、信号通路富集分析,以及蛋白质互作网络分析。根据RNA-seq分析结果,选出20个DEGs进行RT-qPCR验证。结果1.分离和纯化所获小鼠骨髓内EPCs贴壁生长良好,细胞多为短梭形或椭圆形。细胞传代接种后,早期形成集落,逐渐长大,而至汇合。较大集落中心的细胞重叠,外围细胞为单层,形态清晰。单层细胞密集时,呈典型的铺路石样排列。所获EPC传代细胞的表面抗原阳性细胞率检测显示,CD90为97.1%,CD133为83.4%,CD34为90.8%,CD29为23.5%,CD45为8.8%。2.本研究建立的细胞系MBMME2为连续传代细胞系,具有EPCs的一般生物学特征。细胞贴壁生长速率高,对血清的依赖性低,5%FBS的生长培养基能维持细胞的快速增殖。细胞增殖指数为44.8%～47.9%。流式细胞术检测显示,CD90、CD133、CD34、CD31和CD45的阳性细胞率依次为99.7%、36.4%、96.8%、97.5%和0.1%,并得到细胞免疫荧光染色结果的支持。染色体核型多为三倍体。体外成血管实验显示,细胞能排列成多个管横截面样的网络状结构。本细胞系传代方便,大集落和融合层上浮的细胞即能接种培养。3.在人参皂苷Rg1浓度为5～20μmol/L的条件下培养96 h后,小鼠骨髓EPCs的传代细胞和细胞系MBMME2细胞的MTT实验结果显示,两种细胞的吸光值均随人参皂苷Rg1浓度增高表现为先升后降。10μmol/L人参皂苷Rg1组的MTT吸光值最大,5～15μmol/L范围内各组的MTT吸光值均显着高于对照组,20μmol/L浓度组与对照组之间的吸光值差异无显着性意义。集落形成实验显示,5～20μmol/L人参皂苷Rg1各组的EPC集落生成能力都显着高于对照组;10μmol/L组的集落生成率最高,显着高于其它各组。10μmol/L人参皂苷Rg1组的细胞增殖指数显着高于对照组。4.RNA-seq数据显示,与对照组相比,3个人参皂苷Rg1处理组都有许多基因显着差异表达。DEGs功能富集分析表明,DEGs主要与细胞通讯、分子功能调控、发育过程、细胞膜受体、细胞外基质、离子转运等相关,涉及的主要信号通路包括细胞周期、PI3K-Akt、Wnt、MAPK、雌激素、细胞分化等通路。RT-q PCR结果表明,Celsr3、Mapk4、Col3a1、Nos3、Mmp9、Cdkl3、Notch1、Grk4、Bnip3、Mapk7、Mapk11、Mapk8、Stat5a、Gper1、Bnip1、Cdk20基因的表达显着上调,显着下调P21、Casp12、Casp4、Casp6的表达显着下调,支持RNA-seq的结果,这些基因与细胞凋亡和增殖调控等功能密切相关。蛋白互作网络分析显示,Cdc20、CDK4、CDK6、P21、Bub1b等差异基因编码的蛋白处于一些信号转导网络中的重要位置,这些网络主要与细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡、细胞分化及癌症等相关。结论1.采用细胞克隆选择和长期自然传代培养相结合,首次成功建立小鼠骨髓内皮祖细胞系MBMME2。2.在体外培养条件下,人参皂苷Rg1能促进小鼠骨髓内皮祖细胞传代细胞及其细胞系细胞的增殖,并呈明显的浓度依赖性;浓度过高时,其促增殖作用减弱。3.转录组研究揭示,人参皂苷Rg1对MBMME2细胞体外生长的影响机制涉及许多基因表达的上调和下调,这些基因主要参与Jak-Stat、MAPK、Wnt、PI3K-Akt、细胞分化及雌激素等信号通路。
杨琬芳[5]（2020）在《DSF/Ara-C清除高表达ALDH的急性髓系白血病干细胞样细胞的研究》文中进行了进一步梳理目的急性髓系白血病（AML）是一种具有高度异质性的造血系统的恶性肿瘤。近二十年来,随着治疗方法的不断改进,绝大多数AML患者在标准化诱导化疗后达到完全缓解,然而部分患者随后复发并死于该病,因此研究影响AML患者化疗后复发及生存的相关因素,有助于判断高风险患者并给予相应的治疗措施,降低复发风险,改善预后和生存。白血病患者复发原因是体内存在一群白血病干细胞（LSCs）,类似于正常造血干细胞,处于相对静息状态,具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能。目前AML的标准化诱导治疗对白血病细胞具有高度杀伤能力,但是LSCs对此化疗则不敏感。因此,如何识别并清除LSCs是彻底治疗AML的关键。许多研究发现醛脱氢酶（ALDH）活性可用作不同组织中癌症干细胞的标志物;ALDH能够氧化凋亡醛成非致凋性羧酸,使癌细胞免受这些醛的致凋亡作用而得以保护;高表达ALDH的AML患者对标准化治疗耐药,并且具有高ALDH活性的AML细胞高度富集LSCs。本研究首先对初发的AML患者（高表达ALDH和低表达ALDH）临床特性和预后进行比较分析,探索ALDH是否能作为白血病干细胞负荷的标志物,然后利用高表达ALDH细胞模型和NOD/SCID小鼠白血病模型研究DSF和Ara-C联合使用提高化疗药物敏感性,同时更有效降低小鼠体内的白血病细胞负荷,并探讨可能的分子机制,为进一步提高AML缓解率和生存率提供新思路。方法1、病例收集2015年1月至2017年12月间山西医科大学第二医院血液科住院的AML初发患者69例,收集了患者的实验室相关资料（包括基本资料、治疗缓解和复发情况、预后生存情况、ALDH表达、基因突变和染色体核型等）,其中男29例,女40例所有标本均为临床检测剩余样本;10例健康人的骨髓样本（门诊可疑病人检测后排除白血病者）。2、绘制ROC曲线确定界值并分析ALDH表达预后关系依据ALDH的表达水平绘制ROC曲线并确定界值,将患者分为ALDHhigh（ALDH表达高于界值）和ALDHlow（ALDH表达低于值）两组,分析ALDH表达水平和细胞遗传学的关系,ALDH表达水平和患者预后的关系。3、构建ALDH慢病毒表达载体采用RT-PCR法逆转录获取ALDH的cDNA,使用特异引物扩增ALDH基因编码序列（CDS）,双酶切（Not I和EcoR I）PCR产物和慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV后,回收酶切产物后连接,转化进入DH5α后扩增,然后提取质粒,对目的基因序列进行一代测序鉴定,选取无碱基错配,插入、缺失的克隆再扩增大量提取质粒。4、建立稳定表达ALDH和MSCV的UT7和THP1细胞模型慢病毒表达载体ALDH和MSCV和包装质粒按一定比例共转染293T细胞（脂质体法）48h后收病毒悬液并感染UT7和THP1细胞,72h后观察并检测感染效率,感染效率低于90%的进行流式细胞分选,获得稳定表达ALDH和MSCV的UT7和THP1细胞模型。5、CCK-8检测DSF或/和Ara-C对UT7和THP1系列细胞活力的影响本研究分析DSF和Ara-C单独和同时作用UT7系列（UT7、UT7-ALDH和UT7-MSCV）细胞和THP1系列（THP1、THP1-ALDH和THP1-MSCV）细胞,未处理组作对照,使用CCK-8试剂盒分别在0h、24h、48h、72h对各组细胞活力进行检测并分析。6、Annexin V检测DSF或/和Ara-C对UT7和THP1系列细胞凋亡的影响分析DSF和Ara-C单独和同时作用UT7系列细胞和THP1系列细胞,未处理组作对照,48h使用AnnexinV-PE,7-AAD检测各组细胞凋亡情况检测并进行分析。7、Westen blot检测DSF或/和Ara-C对UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞的P65影响P65是NF-κB通路的核心成员,DSF和Ara-C单独和同时作用UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞,未处理组作对照,48h后裂解细胞,提取总蛋白,使用Simple Westen blot检测各处理组P65的表达情况并进行分析,来反映对NF-κB通路的影响。8、通过γ-H2AX（pS139）检测DSF或/和Ara-C对UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞内DNA的影响分析DSF和Ara-C单独或/和联合作用UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞,48h后,使用γ-H2AX（pS139）的免疫荧光抗体对细胞内形成的γ-H2AX（pS139）进行检测,分析细胞中γ-H2AX（pS139）灶形成的情况。9、DSF或/和Ara-C对NOD/SCID白血病小鼠体内白血病负荷的研究对NOD/SCID小鼠进行亚致死计量（1Gy）的辐射清髓,然后植入THP1-ALDH细胞,成功构建白血病小鼠模型。使用DSF或/和Ara-C连续作用5天后,停药持续观察到14天,分析小鼠体内的白血病负荷。结果1、绘制ROC曲线确定界值并分析病人ALDH的表达及ALDH与细胞遗传学、预后关系依据ROC曲线得出表达ALDH的界值为1.85%,健康人骨髓CD34+细胞中ALDH处于较低水平（0.5±0.17%）;AML中ALDH表达悬殊（0-79%）,其中一部分AML患者（35/69）ALDH表达较高（≥1.85%）,称为ALDHhigh患者,其余患者（34/69）ALDH表达≤1.85%则为ALDHlow患者。在ALDH表达和细胞遗传学相关性分析中发现:细胞遗传学高风险组患者ALDH表达较高（15.36±4.46%）,细胞遗传学低风险组患者ALDH表达则较低（1.57±0.74%）。根据ALDH表达将患者分为:ALDHhigh患者和ALDHlow患者,ALDHhigh患者的总生存期（OS）显着低于ALDHlow患者（P<0.01）。由于细胞遗传学中度风险组患者ALDH表达差异较大（0.1-44.4%.）,按ALDH表达将其分成两组并分析OS,同样发现细胞遗传学中度风险组ALDHhigh患者的总生存期呈明显低于ALDHlow患者（P<0.01）。2、构建ALDH慢病毒表达载体将ALDH成功连接至慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,测序鉴定目的基因ALDH序列,无缺失、插入和错配碱基,经Blast比对显示序列准确,成功构建ALDH慢病毒表达载体。3、慢病毒转导UT7和THP1细胞,建立稳定表达目的基因的细胞模型慢病毒表达载体成功构建后,脂质体法共转染293T细胞,制备ALDH慢病毒悬液和MSCV载体对照慢病毒悬液,分别感染UT7和THP1细胞,培养细胞72h后,采用流式细胞术检测细胞感染的阳性率,各组细胞感染效率（GFP）均大于90%,结果显示成功构建了稳定表达目的基因的UT7和THP1细胞模型。4、DSF或/和Ara-C对UT7和THP1系列细胞活力的影响测定DSF和Ara-C对UT7和THP1两种细胞的IC50值。用相应浓度的Ara-C作用于UT7和THP1系列细胞,48h后THP1-ALDH和UT7-ALDH细胞活力抑制不明显,显示其对Ara-C耐药;DSF抑制THP1和UT7系列细胞的增殖能力;DSF联合Ara-c使用48h,THP1-ALDH、UT7-ALDH细胞活力被明显抑制,显示可能逆转了Ara-C耐药;而脐血干细胞的活力不受影响（P>0.05）。5、DSF或/和Ara-C对UT7和THP1系列细胞凋亡的影响Ara-c或/和DSF联合处理UT7和THP1系列48h,流式细胞仪分析凋亡细胞的百分比,显示单独用Ara-c或DSF处理可诱导UT7和THP1系列细胞凋亡（P<0.05）,而DSF和Ara-c共同处理可显着增强凋亡作用（P<0.01）,但是在CD34+CD38-的脐带血干细胞中未发现相应的凋亡（P>0.05）。6、DSF或/和Ara-C抑制UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞p65表达并增加细胞内γ-H2AX单独用DSF和Ara-c处理THP1-ALDH和UT7-ALDH细胞48h可使NF-κB通路的核心成员p65蛋白的表达水平降低（P<0.05）;同时使得细胞内形成γ-H2AX灶;在DSF和Ara-c联合作用下,更加明显降低p65蛋白的表达水平（P<0.001）;同时显着增加了γ-H2AX灶的形成（P<0.001）;在脐带血干细胞中未发现类似结果（P>0.05）。7、DSF或/和Ara-C作用对NOD/SCID白血病小鼠体内白血病负荷的研究通过植入THP1-ALDH细胞成功构建NOD/SCID小鼠白血病模型,使用DSF或/和Ara-C连续作用5天后,停药持续观察到14天,处死小鼠,检测小鼠外周血、骨髓、脾脏的白血病负荷都不同程度的减少（P<0.05）;与单独用药相比,联合使用DSF和Ara-C降低小鼠体内的白血病负荷更明显（P<0.05）。结论1、健康人骨髓CD34+细胞中ALDH处于较低水平（0.5±0.17%）,AML中一部分患者（50.7%）ALDH表达较高（≥1.85%）;细胞遗传学高风险组患者ALDH表达较高（15.36±4.46%）,细胞遗传学低风险组患者ALDH的表达较低（1.57±0.74%）;ALDHhigh患者的总生存期（OS）显着低于ALDHlow患者;在细胞遗传学中等风险组中ALDHhigh患者的总生存期明显低于ALDHlow患者。2、在细胞水平证实了:高表达ALDH的UT7和THP1细胞对化疗药物Ara-C相对耐药;DSF单独使用能抑制白血病干细胞样细胞的活力、诱导凋亡;DSF和Ara-C联合使用,抑制效果更加明显。3、NOD/SCID小鼠模型实验证实:DSF联合Ara-C比单独使用DSF更加明显降低小鼠白血病干细胞样细胞负荷。
张坤[6]（2020）在《人造血干细胞来源的间充质干细胞规模化制备方法研究》文中认为造血干细胞（HSCs）的主要来源是经造血干细胞动员的成人外周血以及脐带血,但由于造血干细胞体外大规模扩增非常困难、获取渠道少、复苏活性低、以及CD34+细胞占比低等缺点,导致目前广泛存储的脐带血失去能治疗恶性血液疾病的价值。致使这一宝贵的生物学资源浪费。间充质干细胞（MSCs）来源广泛,且有组织修复及调节免疫等重要功能,是目前临床应用最广泛的干细胞之一,但由于获取方法不同及供体情况的不同,造成间充质干细胞在体外扩增的数量和质量远不能满足不断增长的临床和科研需求。诱导性多能干细胞（iPSCs）技术是将成体细胞或者其他干细胞转入Oct-4、Sox-2、Klf-4和c-myc等四种或其他转录因子,使细胞重编程成为有类似胚胎干细胞生物学特征的多能性干细胞。本文基于诱导性多能干细胞技术对目前广泛存储的造血干细胞进行重编程,诱导其转化为多能干细胞,并大量扩增和最佳细胞系,并将诱导性多能干细胞重新定向分化为间充质干细胞,为临床和科研提供足够数量的间充质干细胞优质来源。本文的研究内容如下:1、将不携带病原体的脐带血中单核细胞以密度梯度离心法进行富集,检测其中的各种细胞群体,并对其形成集落能力进行验证,再将单核细胞进行磁珠分离,获取其中的CD34+细胞,采用全人工培养基进行体外小规模培养扩增,并检测其表面标记物和细胞纯度。采用三种混合游离环状基因载体作为多能性因子载体,将不携带病原体的造血干细胞进行电穿孔转染,并培养得到6株人诱导性多能干细胞,对细胞进行扩增和冻存。并检测每个细胞株形成克隆能力、生长水平、表面标记物表达率、三胚层分化潜能将上述因素进行分析以获得最佳细胞株用于定向分化。2.将最佳细胞株进行全人工培养基诱导,使其定向分化为间充质干细胞。采集同一供体来源的脐带华通氏胶,分离其中的脐带间充质干细胞。将两种来源的间充质干细胞三种分化能力进行验证。滴定流式细胞术抗体以及确定流式细胞术最佳细胞用量后用流式细胞术对两种间充质干细胞表面标记物进行检测。并检测两种间充质干细胞的微生物污染和细胞核染色体。3.对两种来源的间充质干细胞进行大规模培养,并对其同源性进行分析,比较两种细胞的生长能力,并对两种细胞的P3和P13代细胞表面标记物、细胞周期、凋亡水平、外泌体特异性抗体表达率及培养基中多种细胞因子表达率进行检测分析。结果:1.从无病原体污染的脐带血中分离的CD34+细胞量过低,需进行扩增,扩增获取的CD34+细胞总量为2.32*106,CD34表达率达99.4%,细胞纯度高。转染后的细胞于20日后肉眼可见iPSCs集落形成。同时得到的6株细胞均能强表达多能性干细胞表面标记物SSEA4,Oct4,SOX2,细胞生长曲线正常,接种后第三日起快速增殖。从以上数据分析,6株细胞均为iPSCs,其中最优细胞株为细胞株1,将细胞株1大量扩增后注射至免疫缺陷小鼠,小鼠可长出具备三胚层细胞的畸胎瘤。2.采用两步法能使iPSCs定向分化为间充质干细胞。且其和同一供体脐带来源间充质干细胞（UMSCs）均为长梭状,呈旋涡状生长,并能分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。通过流式细胞术抗体滴定确定其最佳流式抗体用量为2.5μL,对应最佳细胞数为1*105,以此条件进行流式细胞术鉴定原代细胞,两者均为CD73、CD90、CD105表达率大于95%,CD14、CD34、CD45、CD79a、HLA-DR表达率小于1%,确认两种来源的细胞为间充质干细胞,且两种细胞染色体形态均为正常的23对,无核形异常。3.两种细胞的STR分析显示高度一致,确认其来源相同,无外源基因污染。iMSCs生长能力优于UMSCs。iMSCs传至13代时的细胞表面标记物能正常表达,虽其阳性标记物表达率略有下降,但其阳性标记物CD73、CD90、CD105表达率均高于95%,阴性标记物表达率亦小于1%,可以用于临床治疗。而P13代UMSCs表面标物中CD73、CD90、CD105表达率均低于95%,其阴性标记物均小于1%,无法应用于临床治疗。两种细胞的P3和P13代细胞周期分析和细胞凋亡水平检测则显示两种细胞经过体外传代后凋亡期细胞增加。两种细胞P3代凋亡细胞比率均低于1%。P13代iMSCs凋亡细胞率为6.87%,UMSCs凋亡细胞率为44.41%,iMSCs凋亡晚期细胞和死亡细胞率低于同代次的UMSCs。两种细胞的外泌体特异性蛋白表达率亦随着传代次数增加而降低,同代次iMSCs外泌体特异性表面抗原CD63、CD29、CD73表达率显着高于UMSCs。两种细胞培养基上清液中肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、白细胞介素-6、转化生长因子-β1等4种因子的含量均为iMSCs显着高于UMSCs,随传代次数增加,iMSCs的多种因子分泌量有所下降,而UMSCs外泌因子量则显着下降。仅p3代UMSCs培养基上清中的白细胞介素-8量高于iMSCs,但P13代UMSCs细胞培养基上清液中该因子含量低于iMSCs。iMSCs血管内皮生长因子分泌量显着高于UMSCs,且随传代未见显着下降。结论:本研究构建了对脐带血来源造血干细胞的全人工诱导方案,使之能重编程为诱导性多能干细胞。并对iPSCs进行评价,选择最优细胞株向间充质细胞定向分化。构建了iPSCs向MSCs的全人工定向分化方案,使其能定向分化为iMSCs,且通过该方法获得的iMSCs在体外各代次的生物学特征均优于同供体来源的UMSCs。
段越,朱将虎,林锦[7]（2019）在《脐带血衍生干细胞的临床应用前景及相关问题》文中认为脐带血里存在着大量的造血干细胞以及具有治疗潜力的其他类型的干细胞[1-2]。20世纪90年代初,科学家成功地使用了脐带血重建移植患者的血液和免疫系统。脐带血衍生干细胞具有潜在的临床价值、强大的增殖能力以及较小的伦理争议,此外,与源自成人组织的干细胞相比,新生儿干细胞接触病毒和环境毒素的风险较低,脐带血还可以冷冻保存供以后使用,因此,很多脐血库得以建立[3]。近年来,随着研究的深入,许多脐血库的规模不断扩大,除了脐带血以外还一起冷冻保存其他组织,如脐带、胎盘、羊水和羊膜。这些组织除了用作间充
葛俊男[8]（2019）在《脐带血造血干细胞的分离与贮藏工艺过程研究》文中研究指明造血干细胞（hemopoietic stem cell,HSC）在组织内并不是固定的细胞成员,而是作为一群原始的造血细胞被造血组织所包含,同时也能在造血组织及血液中生存。在生长到第二周的人类胚胎的卵黄囊内,造血干细胞就出现了,当人类胚胎发育到第四周的时候,造血干细胞开始在胎肝中出现。当孕妇怀孕达到五个月时,幼体骨髓中的造血功能开始运转,在人类出生后,骨髓就成为了造血干细胞存在的主要场所和主要来源地。根据造血干细胞来源地不同可将造血干细胞移植分为骨髓造血干细胞移植,脐血造血干细胞移植和外周血造血干细胞移植三个组别。没有供者限制这一点就是使用自体脐带血造血干细胞移植的最大优点,并且在移植过后,发生移植物抗宿主病的几率非常小,免疫抑制剂的使用量也大幅减少,几乎没有出现严重并发症,并且费用较低,因此很多用户都选择去储存自体脐带血。本文主要通过实验来研究造血干细胞在提取储存过程中的各种影响因素。第一部分研究了脐带血采集量和分离到的单个核细胞数之间的关系。通过6%羟乙基淀粉密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC）,统计结果显示,脐带血采集量与分离收集的MNC数量之间线性相关,r=0.985,P<0.0001。因此,在不对母婴造成影响的前提下,尽量多的采集脐带血可以增加收集分离的有MNC数量,进而满足移植的需要。第二部分主要研究脐带血不同分离方法对造血干细胞分离效果的影响,本部分首先分析了Ficoll分层法、6%羟乙基淀粉密度梯度离心法和6%羟乙基淀粉自然沉降法三种方法分离脐带血造血干细胞的效果,结果显示,6%羟乙基淀粉密度梯度离心法分离得到的MNC数量最多,6%羟乙基淀粉自然沉降法次之,Ficoll分层法最低。对分离得到的MNC进行半固体琼脂培养,统计的CFU-GM集落数据显示6%羟乙基淀粉密度梯度离心法要明显高于其它两种方法。同时,本部分还对获得的MNC中细胞表型进行对比,与其他两种方法相比,6%羟乙基淀粉密度梯度离心法会分离得到更多的CD3+、CD14+和CD34+细胞。综合上述实验结果可知,6%羟乙基淀粉密度梯度离心法是相对理想的脐带血造血干细胞分离方法。根据文献报道,多种因素会对6%羟乙基淀粉密度梯度离心法的分离效果造成影响。本研究利用响应面法对离心温度,离心力,离心时间三个影响因素进行了分析优化,最终得到在离心温度15℃、离心力1000g及离心时间17.8min时分离效果最佳,此时分离的细胞活力可达到95.7%。第三部分主要研究不同的冻存方法对造血干细胞冻存质量的影响。脐带血造血干细胞低温保存是脐带血库建设和临床移植成功的前提条件。目前,慢速分步冷却法是脐带血干细胞保存的主流方法。在该方法中,降温过程不同对复苏后细胞活力影响很大。本研究选取降温速率,降温时间及降温的终点温度作为三因素探究最佳的降温过程,响应面法结果显示,在降温速率为1.5℃/min、降温时间40h、降温终点温度为-80℃条件下,细胞复苏后活力可达到98.7%。由于快速降温,不产生冰晶和对细胞损伤小,玻璃化法在脐带血造血干细胞的长期保存方面展现出良好的应用前景。本论文对玻璃化法进行了初步的研究。根据文献报道,抗冻剂的种类和添加量,抗冻剂滴加速度以及滴加时的温度都会对玻璃化法冻存的细胞活性产生影响。本实验对抗冻剂人血清白蛋白添加浓度,滴加速度和滴加温度进行了优化,结果显示,在人血清白蛋白终浓度为17.1%、滴加温度为-8.32℃、滴加速度为2.84%/min条件下进行造血干细胞玻璃化冻存,最终细胞复苏活力为99.1%。
靳水玲[9]（2017）在《PRMT1-RBM15调控通路在正常造血调控和恶性造血疾病中作用机制的研究》文中指出蛋白精氨酸甲基化转移酶1（Protein Arginine Methlytransferase 1,PRMT1）是蛋白精氨酸甲基转移酶家族的主要成员。PRMT1有多种组氨酸和非组氨酸底物,它通过甲基化这些底物调控蛋白-蛋白间和蛋白-核酸间的相互作用,发挥表观遗传转录调节、RNA剪接、RNA输出和信号传导功能。PRMT1通过甲基化Runt相关转录因子1（Runt-related Transcription Factor 1,RUNX1）激活转录调节造血。在AML1-ETO的急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia,AML）中,PRMT1与AML1-ETO相互作用,敲低PRMT1的表达能减少由AML1-ETO激活的相关基因表达,减少白血病细胞的增殖并抑制它们的自我更新。PRMT1在新诊断出的儿童急性淋巴细胞白血病患者中的表达显着增高。RNA结合蛋白15（RNA Binding Motif Protein 15,RBM15）是由位于1号染色体的上的RBM15/OTT基因编码的RNA结合蛋白。它能与核RNA输出因子1（Nuclear RNA export factor 1,NXF1）相结合并直接识别RNA输出元素（RNA Transport Element,RTE）,辅助输出含有RTE的基因,促进基因的表达,参与输出通路发挥核输出功能。RBM15与c-Myc结合调节成人造血干细胞向巨核细胞分化。在RBM15基因敲除的成年小鼠中髓细胞及巨核细胞增生异常,并且由于在前B细胞的分化阶段受到阻滞,导致使外周B细胞缺失。我们的前期研究结果发现PRMT1甲基化RBM15蛋白的R578位点,导致甲基化的RBM15蛋白经过E3连接酶介导的泛素化降解,RBM15直接与RUNX1和GATA1的pre-mRNA的内含子区域结合后与SF3B1作用调控它们的RNA可变剪接。但是PRMT1-RBM15在正常造血干细胞向巨核细胞及髓系细胞分化过程中的作用机制仍不清楚。众多研究发现许多造血系统疾病发生表观遗传调控异常和RNA剪切功能的异常。骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic Syndrome,MDS）是一组异质的克隆性干细胞疾病。它的特征是至少一个造血谱系的发育不良和无效造血,且具有发展为急性髓系白血病的危险。基因测序结果显示大约80%的MDS患者携带基因突变,例如表观遗传调节基因（TET2,ASXL1,DNMT3A,IDH1,IDH2,EZH2）,转录因子（ETV6,RUNX1,TP53）,信号传导蛋白（CBL,JAK2,KRAS,NRAS）和与RNA剪接机制相关的基因（SF3B1,SRSF2,U2AF1,ZRSR2）。80%以上的MDS亚型环形铁粒幼细胞性贫血的患者发生剪切因子3b亚型1（Splicing Factor 3b Subunit 1,SF3B1）的基因突变。SF3B1K700E是SF3B1突变最常见的突变位点。SF3B1的突变如何导致红细胞生成缺陷的分子机制仍不清楚。RBM15的RIP-seq分析显示,RBM15与SF3B1和TAL1的内含子区域相结合。TAL1基因编码一个具有螺旋-环-螺旋结构的转录因子,是在造血过程的关键转录因子。它对早期造血和成人造血中红细胞和巨核细胞生成有重要作用。TAL1基因有多个启动子,可编码产生全长的TAL1（TAL1 full-length,TAL1fl）蛋白及短的TAL1（TAL1 short-form,TAL1s）蛋白。此外,TAL1fl mRNA可通过使用在N-末端区域部分的不同翻译起始位点产生不同大小的蛋白质。TAL1s的N末端没有DNA结合域,TAL1s的过表达促进了小鼠骨髓细胞的红细胞分化。所以我们推测PRMT1-RBM15、SF3B1和TAL1之间的相互作用的失调可能在MDS的发病机制中发挥关键作用。本研究第二部分中我们重点阐述了PRMT1-RBM15、SF3B1和TAL1之间的关系。急性巨核细胞白血病（Acute Megakaryoblastic Leukemia,AMKL）中t（1;22）（p13;q13）染色体易位比较常见,这种易位使得1号染色体上RBM15基因和22号染色体上MKL1基因形成融合基因RBM15-MKL1（又叫OTT-MAL）。RBM15和MKL1都是巨核细胞分化的重要基因,RBM15-MKL1融合基因导入的小鼠可以发生像RBM15敲除小鼠一样的巨核细胞分化缺陷。虽然RBM15-AMKL转基因小鼠AMKL的发病率很低,但是当将骨髓增殖白血病基因的突变体（Myloproliferative Leukemia virus mutant,MPLW515L）转入RBM15-MKL1骨髓后,它的AMKL的发病率为100%。6133细胞系是从RBM15-MKL1转基因的小鼠脾脏分离出来的细胞系,它的存活需要依赖干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）。我们前期实验证实了在6133细胞里过表达MPLW515L时激活了PRMT1的表达,并能够使6133细胞呈现无依赖因子的生长。生物信息技术分析发现,PRMT1在急性巨核细胞白血病中表达增高。DB75已经在不同的生物系统被用作研究PRMT1的功能,它能透过293T细胞的细胞膜并抑制PRMT1的活性。我们前期研究发现PRMT1抑制剂DB75能够促进造血干细胞向巨核细胞分化成熟,并且能逆转PRMT1导致的巨核细胞分化障碍。在正在培养的白血病细胞MEG01细胞的培养基中加入20μM的DB75,72h后显着抑制了它们的生长。但是RBM15-MKL1融合基因导致的白血病是否也具有PRMT1表达增高的特性,以及抑制PRMT1的活性能否抑制白血病的异常增殖需要我们进一步研究。综上所述,本研究主要从三个部分探讨PRMT1-RBM15调控通路在正常造血调控和疾病中的作用机制。第一,PRMT1-RBM15调控通路在正常红系及巨核系细胞分化过程中的作用机制;第二,PRMT1-RBM15调控通路在SF3B1K700E突变相关红系异常造血中的作用机制;第三,PRMT1-RBM15调控通路在RBM15-MKL1融合基因相关AMKL中的作用机制。此研究的目的旨在探讨PRMT1-RBM15调控通路是否能够作为治疗相关造血系统疾病的潜在靶点。第一部分:PRMT1-RBM15调控通路在正常红系和巨核系分化过程中的作用机制研究目的以正常脐血干细胞为研究对象,研究PRMT1-RBM15调控通路在正常造血干细胞向巨核细胞及红细胞分化过程中的作用。研究方法收集正常孕妇胎儿脐血,肝素抗凝,应用淋巴细胞分离液分选出单个核细胞,用磁珠分选仪分离脐血CD34+细胞。用磷酸钙包装病毒的方法分别包装PRMT1,RBM15,shPRMT1,shRBM15#1,shRBM15#2慢病毒,用PEG6000的方法把这些病毒浓缩为原体积的1/100。用这些病毒按照常规侵染悬浮细胞的方法分别侵染CD34+细胞。侵染48h后,用流式细胞学的方法或者用嘌呤霉素获得阳性细胞,并把这些阳性细胞分别在2IU/ml的EPO和50ng/ml的TPO的培养基中培养,7天后应用流式细胞学方法分别检测代表红细胞生成的表面抗原CD71和代表成熟巨核细胞表面抗原CD41,CD42的表达。研究结果1.PRMT1-RBM15调控通路调控着造血干细胞向巨核细胞分化。在CD34+脐血干细胞中过表达RBM15或者用PRMT1抑制剂（DB75）抑制PRMT1活性时,生成的成熟巨核细胞的数目增多;过表达PRMT1或者用shRNA的方法敲低RBM15时,生成的成熟巨核细胞的数目减少。2.PRMT1-RBM15调控通路调控着造血干细胞向红细胞分化。在CD34+脐血干细胞中过表达PRMT1或者用shRNA的方法敲低RBM15时,生成的红细胞增多;过表达RBM15或者用PRMT1抑制剂（DB75）抑制PRMT1活性时,生成的红细胞减少。第二部分:PRMT1-RBM15调控通路在SF3B1K700E突变相关红系异常造血中的作用机制研究研究目的研究PRMT1-RBM15调控通路在SF3B1K700E引起的骨髓增生异常综合征中的作用机制。研究方法1.用Real-time PCR及Western Blot的方法分析PRMT1-RBM15调控通路的改变是否影响TAL1两种异构体的表达。2.构建Flag-TAL1s,Flag-TAL1fl慢病毒质粒,用慢病毒原液侵染K562细胞,48h后,用流式细胞仪分选出阳性细胞。提取这些阳性细胞的RNA,反转录为c DNA,Real-time PCR的方法分析内源性的TAL1s、TAL1fl、ALAS2、β-globin和γ-globin的表达。用Benzidine染料分别对上述的阳性细胞进行染色,显微镜计数经Benzidine染色的阳性细胞,了解红细胞比例。构建TAL1s,TAL1fl的慢病毒质粒,用磷酸钙的方法包装病毒,用PEG6000的方法把病毒按照1:100的比例浓缩。用浓缩后的病毒按照侵染悬浮细胞的方法侵染人类脐血CD34+细胞。48h后,用流式细胞仪分选出病毒侵染阳性细胞,并分别把这些阳性细胞培养在含有2IU/ml的EPO的培养基中,7天后流式细胞学检测代表红细胞生成的表面抗原CD71的表达。3.用磷酸钙的方法分别将Flag-TAL1s、Flag-TAL1fl、Flag-TAL1s+ETO2、Flag-TAL1fl+ETO2转入293T细胞中,48h后收取总蛋白,免疫共沉淀纯化出Flag蛋白后用Western Blot的的方法检测ETO2的表达。分别收取在K562细胞中过表达Flag-TAL1s,Flag-TAL1fl的阳性细胞的总蛋白,用上述同样的方法检测检测ETO2的表达。4.野生型Flag-SF3B1和突变型SF3B1K700E慢病毒质粒来自美国Sloan-Kettering癌症中心,提取质粒,送金唯智测序公司测序。测序正确后,用磷酸钙的方法包装慢病毒,用病毒原液侵染K562细胞,48h后,用流式细胞仪分选出病毒侵染阳性细胞,收取细胞的总蛋白,免疫共沉淀的方法纯化出Flag蛋白,用Western Blot的方法分析RBM15的表达。研究结果1.PRMT1-RBM15调控通路调控着TAL1的可变剪接。PRMT1的表达增高或者用shRNA的方法使RBM15的表达敲低时,TAL1s/TAL1fl的mRNA比率和蛋白比率增高,产生的TAL1s增多。RBM15的表达增高和用shRNA敲低PRMT1的表达或者用PRMT抑制剂DB75使PRMT1活性减低时,TAL1s/TAL1fl的mRNA比率和蛋白比率减低,产生的TAL1fl增多。2.TAL1s能促进红细胞的成熟分化。当Flag-TAL1s和Flag-TAL1fl在K562细胞中过表达时,它们的细胞沉淀变红;与TAL1fl过表达的K562细胞相比,TAL1s过表达的K562细胞细胞沉淀变得更红。Real-time PCR分析显示TAL1s的表达增高没有使内源性的TAL1s或TAL1fl的mRNA水平增高,但是TAL1fl的表达增高使内源性的TAL1fl增高,而内源性的TAL1s增高并不明显。TAL1s的表达增高促进K562细胞产生更多的β-globin的mRNA,TAL1fl和TAL1s激活了负责血红素生成基因ALAS2的转录。TAL1s过表达的K562细胞经Benzidine染色的阳性细胞比例高于TAL1fl过表达K562细胞的阳性细胞比例。虽然在脐血干细胞中过表达TAL1s和TAL1fl都能使红细胞生成增多,但是TAL1s能更有效地生成更多的红细胞。同样在脐血干细胞中过表达PRMT1也能使造血干细胞产生更多的CD71红细胞。3.TAL1两种异构体与转录抑制因子ETO2的结合不同。不管是在293T细胞中或者在K562细胞中,TAL1fl与ETO2相互结合,但是TAL1s不与ETO2结合。有文献指出ETO2抑制红系发育,所以TAL1s通过不与ETO2结合促进红系发育。4.SF3B1K700E突变体与RBM15的相互作用增强影响TAL1的mRNA可变剪接。与野生型的SF3B1相比,RBM15与突变型的SF3B1结合增多。突变体SF3B1使TAL1fl的mRNA水平增高更多进而使TAL1s/TAL1fl的mRNA比率减少。野生型的SF3B1使血红蛋白生成相关基因ALAS2、γ-globin和β-globin的mRNA水平增高,但是SF3B1突变体不增加它们的mRNA水平。第三部分:PRMT1-RBM15调控通路在RBM15-MKL1融合基因相关AMKL中的作用机制研究研究目的研究PRMT1-RBM15调控通路在RBM15-MKL1融合基因导致的急性巨核细胞白血病中的作用机制。研究方法1.按照第二部分中分离脐血CD34+细胞的方法分离脐血CD34+细胞,用磷酸钙包装病毒的方法包装RBM15-MKL1和MPLW515L慢病毒,PEG6000的方法把病毒原液浓缩为原体积1/100。用常规侵染悬浮细胞的方法分别用RBM15-MKL1,RBM15-MKL1+MPLW515L,MPLW515L慢病毒侵染CD34+细胞。48h后,用流式细胞仪分选出阳性或双阳性的细胞。1)培养在CD34+细胞成长的培养基中,每天细胞计数;2)利用细胞克隆分析试剂盒做细胞连续克隆形成分析;3)培养在巨核细胞分化培养基中,7天后使用流式细胞学方法分析细胞表面CD41 CD42的表达。4)Real-time PCR方法分析PRMT1的mRNA水平,流式细胞学方法分析PRMT1蛋白水平。3.在1中分选的过表达RBM15-MKL1+MPLW515L的双阳性细胞中加入PRMT1抑制剂DB75。1)应用细胞活性分析试剂盒分析DB75对细胞活性的影响;2)利用细胞克隆试剂盒做细胞连续克隆形成分析;3)培养在巨核细胞培养基中并在7天后使用流式细胞学方法分析细胞表面CD41 CD42的表达。研究结果1.RBM15-MKL1融合蛋白和MPLW515L突变体共同作用能使脐血干细胞长期增殖。当RBM15-MKL1和MPLW515L共同表达在脐血CD34+细胞时能够在造血干细胞培养基中长期存活,并且能够在含有CD34+细胞成长的细胞因子混合物的甲基纤维素的培养基中长期增殖。RBM15-MKL1+MPLW515L共同表达抑制了造血干细胞向巨核细胞分化。不管是mRNA或者是蛋白水平,PRMT1在RBM15-MKL1和MPLW515L共同表达的脐血CD34+细胞中都增高。2.PRMT1抑制剂DB75能抑制RBM15-MKL1+MPLW515L转化的CD34+细胞的增殖。当我们在RBM15-MKL1+MPLW515L共同表达的细胞加入DB75时,这些细胞在三天内停止生长并死亡。DB75能使RBM15-MKL1+MPLW515L共同表达的细胞在甲基纤维素培养基中培养时,细胞克隆形成停止。PRMT1抑制剂DB75能够逆转RBM15-MKL1和MPLW515L导致的白血病模型的巨核细胞成熟障碍,使成熟巨核细胞数目增多。研究结论1.PRMT1-RBM15调控通路在正常造血干细胞向巨核细胞及红细胞分化的过程中具有重要的调控作用。2.在SF3B1K700E突变的骨髓增生异常综合征中,RBM15与SF3B1K700E的结合增强,导致TAL1s的减少从而引起红细胞成熟分化减少。PRMT1的增高引起TAL1s的增加引起与红细胞成熟分化相关的基因ALAS2,β-globin的表达增高,从而导致红细胞数目增多。TAL1s促进红细胞成熟分化的原因是由与它失去了与转录抑制因子ETO2结合。3.PRMT1促进了RBM15-MKL1从造血干细胞向白血病细胞的转化作用。PRMT1抑制剂DB75能够逆转RBM15-MKL1导致的这种转化现象,促进了造血干细胞向巨核细胞分化。PRMT1抑制剂可能会成为治疗RBM15-MKL1引起的AMKL新的靶向药物。
何静,宋瑰琦,吴云[10]（2014）在《静脉输注脐血干细胞移植的护理进展》文中提出自法国Gluckman等1988年采用同胞脐带血移植治愈儿童范可尼贫血以来,全世界已有3万多例患者成功实施了脐血干细胞移植。干细胞具有再生为各种组织器官的潜能,被称为"万能细胞"。脐血（umbilical cord blood,UCB）已成为除骨髓以外的重要间充质干细胞（mesenchy—mal stem cells,MSCs）来源,是细胞替代治疗理想的种子细胞[1]。目前很多疾病,都可借助干细胞技术进行治疗。脐血干细胞排异反应小,再生能力和速度是成人造血干细胞的1020倍。因此,在配型和移植方面具
二、脐血造血干/祖细胞冷藏效果的比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脐血造血干/祖细胞冷藏效果的比较研究（论文提纲范文）
（1）三联袋转移法在脐带血制备中的应用效果（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 传统法 |
| 1.3.2 转移法 |
| 1.3.3 样本检测 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 两组脐血的体积的比较 |
| 2.2 两组脐血的红细胞去除率的比较 |
| 2.3 两组脐血的主要质量参数的比较 |
| 3 讨论 |
（2）回阳生肌汤和鸡血藤对慢性皮肤溃疡愈合过程中MSCs趋化和迁移功能的调节作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词(表) |
| 综述 |
| 综述一 干细胞在创面修复中的研究进展 |
| 1 表皮干细胞 |
| 2 间充质干细胞 |
| 3 毛囊干细胞 |
| 4 细胞外囊泡 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 回阳生肌法治疗慢性皮肤溃疡的研究进展 |
| 1 疮疡的阴阳辨证 |
| 2 回阳生肌法的现代理论体系 |
| 3 回阳生肌法促进慢性皮肤溃疡愈合的机制 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 实验一 回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 回阳生肌汤对db/db糖尿病小鼠伤口愈合及BMSCs增殖能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 回阳生肌汤对骨髓抑制大鼠伤口愈合及BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 鸡血藤水提物对骨髓抑制大鼠伤口愈合及BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验五 回阳生肌汤和鸡血藤水提物体外对氧化损伤大鼠BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 存在的问题与不足 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（3）地中海贫血症红细胞谱系发育分化基因筛查及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 地中海贫血的定义和分类 |
| 1.2.1 α地中海贫血 |
| 1.2.2 β地中海贫血 |
| 1.3 地中海贫血的治疗现状和预防 |
| 1.3.1 常规疗法 |
| 1.3.2 造血干细胞移植 |
| 1.3.3 基因活化疗法 |
| 1.3.4 地中海贫血预防现状 |
| 1.4 造血调控与造血干细胞的研究 |
| 1.4.1 血细胞发生的基本概念 |
| 1.4.2 造血细胞发育阶段和鉴别方法 |
| 1.4.3 早期造血的三个阶段 |
| 1.4.4 早期造血胎儿红细胞生成和血红蛋白合成 |
| 1.4.5 多能造血干细胞维持自我更新的分子基础 |
| 1.4.6 造血干细胞多态性 |
| 1.4.7 造血祖细胞多态性 |
| 1.4.8 造血干细胞和祖细胞的主要区别 |
| 1.4.9 造血干细胞和造血祖细胞表面标志 |
| 1.4.10 造血干细胞的体外和体内检测方法 |
| 1.4.11 造血干细胞和祖细胞富集方法 |
| 1.4.12 造血干细胞移植问题 |
| 1.4.13 造血干细胞体外扩增问题 |
| 1.5 造血调控的关键:细胞因子 |
| 1.5.1 最早研究的细胞因子:集落刺激因子 |
| 1.5.2 作用于早期造血细胞的细胞因子 |
| 1.5.3 其他类型参与造血调控的细胞因子 |
| 1.5.4 与红系分化相关的调控因子 |
| 1.5.5 转录因子在造血调控中的作用 |
| 1.6 红细胞系统发育以及相关调控 |
| 1.6.1 红系祖细胞阶段 |
| 1.6.2 红系前体细胞阶段 |
| 1.6.3 红细胞脱核和释放成熟阶段 |
| 1.6.4 红细胞生成的调控机制 |
| 1.7 本文的主要研究内容 |
| 第2章 实验方法与材料 |
| 2.1 样本来源 |
| 2.2 主要试剂和耗材 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 羊水细胞培养 |
| 2.4.2 细胞冻存 |
| 2.4.3 细胞计数 |
| 2.4.4 脐带血分离单个核细胞 |
| 2.4.5 磁珠分选CD34阳性细胞 |
| 2.4.6 流式细胞仪分析和分选不同阶段的红细胞 |
| 2.4.7 体外造血集落检测 |
| 2.4.8 WES数据分析 |
| 第3章 地中海贫血携带者基因型调查研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 羊水细胞体外培养 |
| 3.3 地中海贫血携带者外显子测序结果 |
| 3.3.1 地中海贫血携带者临床和基因分类 |
| 3.3.2 全外显子组测序结果和数据分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 脐带血造血干细胞体外诱导分化研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 脐带血造血干细胞的分离纯化和鉴定 |
| 4.3 脐带血造血干细胞体外诱导分化和造血集落检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 内皮祖细胞研究进展 |
| 1.1.1 内皮祖细胞的发现及其意义 |
| 1.1.2 内皮祖细胞的培养与鉴定 |
| 1.1.3 内皮祖细胞系 |
| 1.1.4 内皮祖细胞的应用研究 |
| 1.1.5 内皮祖细胞增殖研究进展 |
| 1.2 人参皂苷Rg1的药效及其作用机制的研究进展 |
| 1.2.1 人参皂苷Rg1药效研究的概述 |
| 1.2.2 人参皂苷Rg1作用机制的研究 |
| 1.3 本研究的目的及总体设计 |
| 第二章 小鼠骨髓EPCs的分离、培养与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 差速贴壁法 |
| 2.1.5 二次酶消化法 |
| 2.1.6 纯化传代细胞培养 |
| 2.1.7 集落形成实验 |
| 2.1.8 细胞表面抗原表达检测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 细胞形态学观察结果 |
| 2.2.2 集落特征 |
| 2.2.3 细胞表面抗原阳性细胞率 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小鼠骨髓内皮祖细胞系MBMME2的建立与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 骨髓EPCs分离和纯化 |
| 3.1.5 细胞克隆培养和筛选 |
| 3.1.6 传代培养 |
| 3.1.7 细胞系的保存与复苏 |
| 3.1.8 细胞生长对FBS依赖性的观察 |
| 3.1.9 细胞增殖能力的观察 |
| 3.1.10 细胞周期分析 |
| 3.1.11 核型分析 |
| 3.1.12 流式细胞术 |
| 3.1.13 细胞免疫荧光染色 |
| 3.1.14 体外成血管实验 |
| 3.1.15 统计学分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 细胞形态学观察结果 |
| 3.2.2 细胞生长特性 |
| 3.2.3 细胞周期分布 |
| 3.2.4 染色体核型 |
| 3.2.5 细胞表面抗原阳性细胞率 |
| 3.2.6 体外成血管实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 细胞传代培养 |
| 4.1.5 MTT比色法 |
| 4.1.6 集落形成实验 |
| 4.1.7 细胞周期分析 |
| 4.1.8 统计学分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 细胞增殖速率 |
| 4.2.2 集落形成能力 |
| 4.2.3 细胞周期分布 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 人参皂苷Rg1 对小鼠内皮祖细胞系MBMME2 细胞生长影响的转录组学研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 实验分组 |
| 5.1.4 RNA-Seq流程 |
| 5.1.5 RT-q PCR |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 RNA样本浓度与质量检测结果 |
| 5.2.2 测序数据质量评价 |
| 5.2.3 样本间Venn分析 |
| 5.2.4 样本间的PCA分析 |
| 5.2.5 差异基因聚类分析 |
| 5.2.6 差异基因表达分析 |
| 5.2.7 功能注释分析 |
| 5.2.8 GO功能富集分析 |
| 5.2.9 KEGG富集分析 |
| 5.2.10 DEGs信号通路分析 |
| 5.2.11 主要差异蛋白互作网络 |
| 5.2.12 RT-q PCR |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 人参皂苷Rg1对MBMME2 促增殖作用机制 |
| 5.3.2 MBMME2 对人参皂苷Rg1 的耐受机制 |
| 5.4 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 专业名词缩略语表(Abbreviations) |
| 附录二 攻读学位期间发表的主要论文及专利 |
| 致谢 |
（5）DSF/Ara-C清除高表达ALDH的急性髓系白血病干细胞样细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 第一部分 醛脱氢酶活性与急性髓系白血病患者预后关系研究 |
| 1 前言 |
| 2 研究对象和方法 |
| 2.1 研究对象与分组 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 3 结果 |
| 3.1 AML患者和正常人的ALDH活性的比较 |
| 3.2 初发患者和复发患者的ALDH活性的比较 |
| 3.3 AML患者的ALDH活性和细胞遗传学及预后关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 DSF或/和Ara-c对高表达ALDH的AML干细胞样细胞的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2 主要实验方法 |
| 2.3 DSF或/和Ara-c对UT7 和THP1系列细胞增殖能力影响 |
| 2.4 DSF或/和Ara-c对UT7 和THP1系列细胞凋亡的影响实验 |
| 2.5 DSF或/和Ara-c对UT7-ALDH、THP1-ALDH细胞DNA的影响实验 |
| 2.6 Western Blot |
| 3 结果 |
| 3.1 慢病毒表达载体的构建及测序鉴定 |
| 3.2 慢病毒包装 |
| 3.3 DSF或/和Ara-C对UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞增殖的分析 |
| 3.4 DSF或/和Ara-C使用对白血病干细胞样细胞的凋亡作用 |
| 3.5 DSF或/和Ara-C抑制UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞p65表达并增加细胞内γ-H_2AX |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 DSF或/和Ara-c对白血病小鼠模型作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 主要试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 成功建立小鼠THP1-ALDH细胞移植后白血病模型 |
| 3.2 Ara-C或/和DSF对白血病小鼠治疗情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白血病干细胞 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）人造血干细胞来源的间充质干细胞规模化制备方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写索引 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 干细胞简介 |
| 1.1.1 干细胞的定义和分类 |
| 1.1.2 诱导性多能干细胞 |
| 1.1.3 间充质干细胞 |
| 1.1.4 造血干细胞 |
| 1.1.5 造血干细胞向间充质干细胞的定向分化方案的现状 |
| 1.2 干细胞的检测与鉴定 |
| 1.2.1 干细胞的增殖能力检测 |
| 1.2.2 流式细胞术检测 |
| 1.2.2.1 造血干细胞的表面标记物 |
| 1.2.2.2 人诱导性多能干细胞的表面标记物 |
| 1.2.2.3 人间充质干细胞的表面标记物 |
| 1.2.3 免疫荧光染色检测 |
| 1.2.4 细胞分化能力 |
| 1.2.5 细胞外源性污染检测 |
| 1.3 间充质干细胞的外泌体和旁分泌研究 |
| 1.3.1 间充质干细胞外泌体的分离方法 |
| 1.3.2 间充质干细胞外泌体的鉴定和检测方法 |
| 1.3.3 间充质干细胞旁分泌因子 |
| 第2章 诱导性多能干细胞系的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞与载体 |
| 2.1.2 主要设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 用于重编程的造血干细胞获取 |
| 2.2.1.1 脐带血的病原体检测 |
| 2.2.1.2 脐带血单核细胞的富集 |
| 2.2.1.3 单脐带血核细胞表面标记物的鉴定和分群 |
| 2.2.1.4 单核细胞的体外成集落水平验证 |
| 2.2.1.5 造血干细胞的纯化 |
| 2.2.1.6 造血干细胞的培养 |
| 2.2.1.7 造血干细胞的流式细胞术鉴定 |
| 2.2.2 重编程造血干细胞制备诱导性多能干细胞 |
| 2.2.2.1 游离重编程载体转染造血干细胞 |
| 2.2.2.2 诱导性多能干细胞培养 |
| 2.2.2.3 选取诱导性多能干细胞克隆和扩增 |
| 2.2.2.4 诱导性多能干细胞收集和冻存 |
| 2.2.3 诱导性多能干细胞的鉴定和检测 |
| 2.2.3.1 诱导性多能干细胞的细胞生长水平比较 |
| 2.2.3.2 诱导性多能干细胞的表面标记物鉴定 |
| 2.2.3.3 诱导性多能干细胞的畸胎瘤试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 脐带血的病原体检测结果 |
| 2.3.2 单核细胞的表面标记物鉴定和分群、计数 |
| 2.3.3 单核细胞的体外集落形成试验结果 |
| 2.3.4 造血干细胞的纯化后培养和流式细胞术检测其表面标记物 |
| 2.3.5 造血干细胞转染后细胞状态 |
| 2.3.6 诱导性多能干细胞的集落形成能力 |
| 2.3.7 诱导性多能干细胞表面标记物检测结果 |
| 2.3.8 诱导性多能干细胞生长水平 |
| 2.3.9 诱导性多能干细胞的畸胎瘤试验 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 两种间充质干细胞的制备和鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用生物样本和外检 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞的制备 |
| 3.2.1.1 诱导性多能干细胞的复苏培养 |
| 3.2.1.2 分步诱导多能性干细胞定向分化为间充质干细胞 |
| 3.2.1.3 诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞的扩增培养 |
| 3.2.2 同一供体来源的脐带间充质干细胞的制备 |
| 3.2.2.1 脐带来源间充质干细胞的分离 |
| 3.2.2.2 脐带来源间充质干细胞的扩增培养 |
| 3.2.3 两种间充质干细胞的鉴定和检测 |
| 3.2.3.1 细胞细菌、真菌污染检测 |
| 3.2.3.2 细胞支原体污染检测 |
| 3.2.3.3 细胞内毒素污染检测 |
| 3.2.3.4 两种来源间充质干细胞分化潜能检测 |
| 3.2.3.5 间充质干细胞流式细胞术检测抗体滴定试验 |
| 3.2.3.6 间充质干细胞流式细胞术检测最佳细胞数的确定 |
| 3.2.3.7 流式细胞术检测细胞表面标记物 |
| 3.2.3.8 检测两种来源细胞的染色体核型 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 诱导性多能干细胞细胞复苏扩增 |
| 3.3.2 更换定向分化培养基后的细胞状态 |
| 3.3.3 两种来源的间充质干细胞的细胞形态学比较 |
| 3.3.4 两种来源干细胞的细菌、真菌污染检测 |
| 3.3.5 细胞支原体污染检定 |
| 3.3.6 细胞内毒素污染检定 |
| 3.3.7 细胞分化能力检定 |
| 3.3.8 流式细胞术检测间充质干细胞最佳抗体用量 |
| 3.3.9 流式细胞术检测间充质干细胞最佳细胞数 |
| 3.3.10 间充质干细胞表面标记物检定 |
| 3.3.11 细胞染色体核型分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 脐带来源间充质干细胞与诱导性多能干细胞来源间充质干细胞的生物学特征比较 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 样本送检 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 两种细胞短串联重复序列分析比较 |
| 4.2.2 两种细胞生长能力比较 |
| 4.2.3 P3和P13代两种细胞表面标记物检测比较 |
| 4.2.4 P3和P13代两种细胞细胞周期比较 |
| 4.2.5 P3和P13代两种细胞凋亡水平比较 |
| 4.2.6 P3和P13代两种细胞外泌体分离 |
| 4.2.7 P3和P13代两种细胞外泌体表面标记物流式检测 |
| 4.2.8 两种细胞P3和P13 代细胞上清液中各种常见因子表达量检测 |
| 4.2.8.1 HGF含量检测 |
| 4.2.8.2 IGF-1 含量检测 |
| 4.2.8.3 IL-6 含量检测 |
| 4.2.8.4 IL-8 含量检测 |
| 4.2.8.5 VEGF含量检测 |
| 4.2.8.6 TGF-β1 含量检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 细胞STR分析 |
| 4.3.2 细胞生长水平比较 |
| 4.3.3 细胞表面标记物比较 |
| 4.3.4 细胞周期比较 |
| 4.3.5 细胞凋亡水平比较 |
| 4.3.6 细胞外泌体特异性标记物比较 |
| 4.3.7 细胞培养基上清液中各种常见因子表达量检测 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 |
（7）脐带血衍生干细胞的临床应用前景及相关问题（论文提纲范文）
| 1 脐带血造血干细胞 |
| 2 MSCs |
| 3 EPCs |
| 4 脐带血干细胞的其他临床应用 |
| 5 脐带血及新生儿干细胞组织库 |
| 6 小结 |
（8）脐带血造血干细胞的分离与贮藏工艺过程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 造血干细胞概述 |
| 1.2 造血干细胞移植 |
| 1.2.1 定义 |
| 1.2.2 移植的适应症 |
| 1.2.3 造血干细胞移植过程 |
| 1.3 脐带血概述 |
| 1.3.1 脐带血研究的意义 |
| 1.3.2 脐带血储存 |
| 1.4 脐带血干细胞 |
| 1.4.1 脐带血干细胞特征 |
| 1.4.2 脐带血干细胞分离工艺 |
| 1.4.3 脐带血干细胞储存 |
| 1.4.4 脐带血干细胞移植的特点 |
| 1.5 本论文研究的内容、目的与意义 |
| 第2章 脐带血采集量与单个核细胞数的关系 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料和仪器 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 本章小结 |
| 第3章 不同分离方法对造血干细胞分离效果的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料和仪器 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同分离方法检测结果 |
| 3.2.2 6%羟乙基淀粉密度梯度离心法工艺优化 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 脐带血造血干细胞的冻存工艺研究 |
| 4.1 常规慢速冻存工艺研究 |
| 4.1.1 材料与方法 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 脐带血造血干细胞分离与分析 |
| 4.2.2 降温速率的优化结果 |
| 4.2.3 玻璃化冻存方案研究结果 |
| 4.3 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间所发表的论文 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）PRMT1-RBM15调控通路在正常造血调控和恶性造血疾病中作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 PRMT1-RBM15在正常造血干细胞向巨核细胞及红细胞分化过程中的调控机制研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分PRMT1-RBM15调控通路在SF3B1~(K700E)突变引起的骨髓增生异常综合征中的作用机制研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分PRMT1-RBM15调控通路在RBM15-MKL1融合基因导致的急性巨核细胞白血病中的作用机制研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 蛋白精氨酸甲基化转移酶与肿瘤 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（10）静脉输注脐血干细胞移植的护理进展（论文提纲范文）
| 1脐血干细胞移植的特点 |
| 2脐血干细胞移植的临床应用 |
| 3脐血的冻存与复温 |
| 4静脉输注脐血的方法与输注时间 |
| 5脐血输注的不良反应 |
| 6脐血输注的护理措施 |
| 7小结 |
四、脐血造血干/祖细胞冷藏效果的比较研究（论文参考文献）
- [1]三联袋转移法在脐带血制备中的应用效果[J]. 吴洁莹,陈劲松,吴韶清,陆琰,汤雪薇,李焱. 中国当代医药, 2021(15)
- [2]回阳生肌汤和鸡血藤对慢性皮肤溃疡愈合过程中MSCs趋化和迁移功能的调节作用研究[D]. 刘青武. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]地中海贫血症红细胞谱系发育分化基因筛查及机制研究[D]. 杨最. 哈尔滨工业大学, 2020(01)
- [4]人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究[D]. 唐琳. 湖南师范大学, 2020(01)
- [5]DSF/Ara-C清除高表达ALDH的急性髓系白血病干细胞样细胞的研究[D]. 杨琬芳. 山西医科大学, 2020
- [6]人造血干细胞来源的间充质干细胞规模化制备方法研究[D]. 张坤. 重庆理工大学, 2020(08)
- [7]脐带血衍生干细胞的临床应用前景及相关问题[J]. 段越,朱将虎,林锦. 发育医学电子杂志, 2019(03)
- [8]脐带血造血干细胞的分离与贮藏工艺过程研究[D]. 葛俊男. 河北科技大学, 2019(02)
- [9]PRMT1-RBM15调控通路在正常造血调控和恶性造血疾病中作用机制的研究[D]. 靳水玲. 郑州大学, 2017(11)
- [10]静脉输注脐血干细胞移植的护理进展[J]. 何静,宋瑰琦,吴云. 安徽医学, 2014(02)
标签：造血干细胞论文; 脐带血论文; 干细胞论文; 急性髓性白血病论文; 急性淋巴细胞性白血病论文;